საჯარო მონაცემთა ანალიზი
მონაცემები SARS-CoV-2 შტოების შესახებ და ნიმუშის აღების თარიღი ჩილედან ხელმისაწვდომი თანმიმდევრობებიდან მიღებული იქნა Consorcio Genomas CoV2 საიტიდან, რომელიც ხელმისაწვდომია მისამართზე: https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. ვაქცინაციის მონაცემები მიღებული იქნა მეცნიერების, ტექნოლოგიების, ცოდნისა და ინოვაციების სამინისტროს საჯარო მონაცემებიდან, რომელიც ხელმისაწვდომია მისამართზე https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (პროდუქტი 83).
ინფექციურობის ანალიზი
მომზადდა ფსევდოტიპირებული ვირუსები, რომლებიც ატარებენ სხვადასხვა SARS-CoV-2 მწვერვალებს, როგორც ადრე აღვწერეთ.12. მოკლედ, აივ-1-ზე დაფუძნებული SARS-CoV-2 ფსევდოტიპები წარმოიქმნა HEK293T უჯრედებში pNL4.3-ΔEnv-Luc-ის ტრანსფექციით შესაბამის pCDNA-SARS-CoV-2 Spike კოდირების ვექტორთან ერთად 1:1 მოლური თანაფარდობით. პლაზმიდები, რომლებიც კოდირებენ კოდონით ოპტიმიზებულ სპიკს, რომელსაც აკლია C-ტერმინალური ბოლოს ბოლო 19 ამინომჟავა (SΔ19), რომელიც ცნობილია, რომ თავიდან აიცილებს შეკავებას ენდოპლაზმურ ბადეში.12 მიღებული იყო გენის სინთეზით ან მორგებული ადგილზე მიმართული მუტაგენეზით (GeneScript) და შეიცავდა შემდეგ მუტაციებს: ხაზი A (საცნობარო თანმიმდევრობა), ხაზი B (D614G), ხაზი B.1.1.7 (Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H), ხაზი P.1 (L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, D1027G, H37Y, T75G, H76I, T246G, T252 452, L490Q, F614S, D859G, T3,000N). თითოეული ფსევდოტიპის პრეპარატი გაწმენდილი იყო ცენტრიფუგირებით 1 rpm-ზე ოთახის ტემპერატურაზე, რაოდენობრივად განსაზღვრული იყო HIV-24 Gag p50 Quantikine ELISA ნაკრების (R&D სისტემები) გამოყენებით, ალიკოტირებული 80% ნაყოფის მსხვილფეხა რქოსანი შრატში (Sigma-Aldrich) და ინახება -1 °C-მდე. გამოყენება. სხვადასხვა რაოდენობით ფსევდოტიპური ვირუსები (როგორც განსაზღვრულია აივ-24 p2 პროტეინის დონეებით) გამოიყენეს HEK-ACE48 უჯრედების დასაინფიცირებლად და 96 საათის შემდეგ ციცინათელა ლუციფერაზას აქტივობა გაზომილი იყო ლუციფერაზას ანალიზის რეაგენტის (პრომეგა) გამოყენებით Glomax XNUMX მიკროპლატაში. ლუმინომეტრი (პრომეგა).
ნეიტრალიზაციის ანალიზი
ფსევდოტიპური ვირუსის ნეიტრალიზაციის ანალიზი ჩატარდა არსებითად, როგორც ადრე აღვწერეთ12. მოკლედ, პლაზმის ნიმუშების სერიული განზავება (1:4-დან 1:8748-მდე) მომზადდა DMEM-ში 10% ნაყოფის მსხვილფეხა რქოსანი შრატით და ინკუბირებული იყო 5 ნგ p24-ით თითოეული ფსევდოტიპირებული ვირუსის 1 საათის განმავლობაში 37 °C-ზე და შემდეგ, 1×104 HEK-ACE2 უჯრედები დაემატა თითოეულ ჭაბურღილს. HEK293T უჯრედები (არ გამოხატავენ ACE2) ინკუბირებული ფსევდოტიპირებული ვირუსით (A შტოში) გამოყენებული იყო, როგორც უარყოფითი კონტროლი. უჯრედები ლიზიზირებული იყო 48 საათის შემდეგ და ციცინათელა ლუციფერაზას აქტივობა გაზომილი იყო ლუციფერაზას ანალიზის რეაგენტის (პრომეგა) გამოყენებით Glomax 96 Microplate luminometer-ში (Promega). გაანგარიშებული იყო ნეიტრალიზაციის პროცენტი თითოეული განზავებისთვის და თითოეული ნიმუშის ID50 გამოითვალა GraphPad Prism ვერსიის 9.0.1 გამოყენებით.
სტატისტიკური ანალიზი
სტატისტიკური ანალიზები ჩატარდა GraphPad Prism პროგრამული უზრუნველყოფის ვერსიის 9.1.2 გამოყენებით. მრავალჯერადი ჯგუფის შედარება ანტისხეულების ტიტრების (NAbTs) გასანეიტრალებლად SARS-CoV-2 ფსევდოტიპური ვირუსების პანელის წინააღმდეგ, ასევე NAbs პასუხების შედარება სქესის და კვამლის სტატუსის მიხედვით ჩატარდა დაწყვილებული Wilcoxon ხელმოწერილი ტესტის გამოყენებით. ფაქტორის ცვლილება გამოითვალა, როგორც გეომეტრიული საშუალო ტიტრის სხვაობა ID-ში50 ველური ტიპის ფსევდოტიპურ ვირუსთან შედარებით. კორელაციის ანალიზი NAbT-ებსა და ასაკს ან BMI-ს შორის ჩატარდა Spearman-ის ტესტის გამოყენებით. ცალმხრივი ANOVA და ტუკის მრავალჯერადი შედარების ტესტი ჩატარდა ინფექციურობის სტატისტიკური ანალიზისთვის. p მნიშვნელობა ≤0.05 ჩათვლილი იყო სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი.
ეთიკური დამტკიცება
კვლევის პროტოკოლი დამტკიცდა ჩილეს უნივერსიტეტის მედიცინის ფაკულტეტის ეთიკის კომიტეტის მიერ (პროექტები N° 0361-2021 და N° 096-2020) და Clínica Santa Maria (პროექტი N°132604-21). ყველა დონორმა ხელი მოაწერა ინფორმირებულ თანხმობას და მათი ნიმუშები ანონიმური იყო.
ლამბდას ვარიანტში მწვერვალის მუტაციების გავლენა ინფექციურობაზე და ანტისხეულების პასუხებზე
ჩილედან 3695 თანმიმდევრობის ანალიზი, რომელიც დეპონირებულია GISAID-ში 24 ივნისის მდგომარეობითth 2021 წელი გვიჩვენებს SARS-CoV-2 ვარიანტების გამა და ლამბდას აშკარა დომინირებას ბოლო ტრიმესტრის აღრიცხვის დროს, ერთად, ყველა თანმიმდევრობის 79%-ისთვის.
საინტერესოა, რომ ეს პერიოდი ხასიათდება მასიური ვაქცინაციის კამპანიით, რომლის დროსაც სამიზნე პოპულაციის 65.6%-მა (18 წლის და უფროსი ასაკის პირებმა) მიიღო ვაქცინაციის სრული სქემა 27 ივნისის მდგომარეობით.th 2021
იმის გათვალისწინებით, რომ სრული სქემით ინოკულირებული ადამიანების 78.2%-მა მიიღო ინაქტივირებული ვირუსის ვაქცინა CoronaVac Sinovac Biotech-ისგან, ჩვენ ვცდილობდით გამოგვეკვლია ლამბდას ვარიანტში არსებული მწვერვალების მუტაციების გავლენა ამ ვაქცინის მიერ გამოწვეულ ანტისხეულების განეიტრალებელ შესაძლებლობებზე.
ამისთვის, ჩვენ შევქმენით აივ-1-ზე დაფუძნებული SARS-CoV-2 ფსევდოტიპური ვირუსები, რომლებიც ატარებენ ცილას ვუჰან-1 საცნობარო შტოდან (ველური ტიპი; ხაზი A), D614G მუტაცია (შესაბამი B) და ალფა (შესაბამი B). .1.1.7), გამა (ხაზი P.1) და ლამბდა (ხაზი C.37) ვარიანტები.
ვირუსის მომზადების დროს, ჩვენ მუდმივად ვაკვირდებოდით, რომ ლამბდა სპიკის მატარებელი ფსევდოტიპური ვირუსით ინფიცირებული უჯრედები წარმოქმნიდნენ მნიშვნელოვან უფრო მაღალ ბიოლუმინესცენტურ მნიშვნელობებს D614G მუტანტთან ან ალფა და გამა ვარიანტებთან შედარებით, რაც მიუთითებს გაზრდილ ინფექციურობაზე, რომელიც გამოწვეულია ლამბდა სპიკის პროტეინით.
ფიგურა 1.ინფექციურობა განპირობებულია სხვადასხვა მწვერვალებით.
(A) SARS-CoV-2 მწვერვალის ცილის სქემატური წარმოდგენა და ამ კვლევაში გამოყენებული ვარიანტები. შტოები მითითებულია ფრჩხილებში. RBD, რეცეპტორების დამაკავშირებელი დომენი, CM; ციტოპლაზმური კუდი.
(B) თითოეული ხაზის ფსევდოტიპების ტიტრირება აივ-1 p24-ის ექვივალენტური რაოდენობით გამოყენებით. ციცინათელა ლუციფერაზას აქტივობა გაზომილი იყო, როგორც ფარდობითი ლუმინესცენციის ერთეულები (RLU) ინფიცირებიდან 48 საათის შემდეგ. საშუალო და SD გამოითვლებოდა წარმომადგენლობითი სამმაგი ექსპერიმენტიდან.
შემდეგ, ჩვენ გამოვიყენეთ ზემოთ ნახსენები ფსევდოტიპური ვირუსები, რათა ჩავატაროთ ნეიტრალიზაციის ანალიზი 79 პლაზმის ნიმუშის გამოყენებით ჯანსაღი ჯანდაცვის მუშაკებისგან ჩილეს უნივერსიტეტიდან და კლინიკა სანტა მარიადან სანტიაგოში, ჩილე.
ჩვენ გამოვრიცხეთ 4 ნიმუში, რადგან ვერ გამოვთვალეთ ID50 ტიტრი. გაანალიზებული ნიმუშებიდან 73% შეესაბამებოდა ქალებს, საშუალო ასაკი 34 წელი (IQR 29 – 43) და სხეულის მაქსიმალური ინდექსი (BMI) 25 (IQR 22.7 – 27). იმუნიზაციის პერიოდის განმავლობაში მონაწილეთა 20.5%-მა განაცხადა, რომ აქტიური მწეველია. ნიმუშები მიღებულ იქნა საშუალო 95 დღის განმავლობაში (IQR 76 – 96) CoronaVac ვაქცინის მეორე დოზის შემდეგ
ჩვენ დავაკვირდით, რომ ფსევდოტიპური ვირუსის განეიტრალებამ, რომელიც ატარებს ველური ტიპის სპაიკის პროტეინს, გამოიწვია 50% ინჰიბიტორული განზავება (ID50) საშუალო ტიტრი 191.46 (154.9 – 227.95, 95% CI,), მაშინ როცა ეს იყო 153.92 (115.68 – 192.16, 95% CI), 124.73 (86.2 – 163.2, 95 – 104.57 CI), 75.02% CI. ) და 134.11 (95 – 78.75, 49.8% CI) ფსევდოტიპური ვირუსებისთვის, რომლებიც ატარებენ სპაიკის ცილას D107.6G მუტანტიდან ან ალფა, გამა და ლამბდა ვარიანტებიდან, შესაბამისად.
ჩვენ ასევე დავაკვირდით, რომ ID-ის საშუალო გეომეტრიული ტიტრი50 ტიტრი შემცირდა 3.05-ით (2.57 – 3.61, 95% CI) ლამბდა სპიკის მატარებელი ფსევდოტიპური ვირუსისთვის, 2.33 (1.95 – 2.80, 95% CI) გამა მწვერვალისთვის, 2.03 (1.71 – 2.41% CI). Alpha spike-სთვის და 95 (1.37 – 1.20, 1.55% CI) D95G spike-ისთვის Wild ტიპის სპაიკთან შედარებით.
არანაირი კორელაცია სქესს, ასაკს, სხეულის მასის ინდექსს (BMI) ან კვამლის სტატუსსა და ანტისხეულების განეიტრალებელ ტიტრებს შორის არ დაფიქსირებულა ჩვენს საკვლევ კოჰორტაში.
ფიგურა 2.ნეიტრალიზაციის ანალიზი CoronaVac ვაქცინების პლაზმის ნიმუშების გამოყენებით
(A) ცვლილებები საპასუხო 50% ნეიტრალიზაციის ტიტრში (ID50) პლაზმის ნიმუშებში CoronaVac ვაქცინის 75 მიმღებისაგან D614G-ის (შემწეობა B), ალფა (შესავალი B.1.1.7),
გამა (შესაბამისი P.1) და ლამბდა (ხაზობა C.37) ვარიანტები ველური ტიპის ვირუსთან შედარებით. შედეგები ნაჩვენებია, როგორც სხვაობა შესატყვისი ნიმუშების ნეიტრალიზაციის ტიტრებში. P მნიშვნელობები ID-ის შედარებისთვის50 გამოითვლება Wilcoxon ხელმოწერილი რანგის ტესტით.
(B) უჯრის ნახაზები მითითებულია ID-ის მედიანური და ინტერკვარტილური დიაპაზონი (IQR).50 თითოეული ფსევდოტიპირებული ვირუსისთვის. ფაქტორების ცვლილებები ნაჩვენებია როგორც გეომეტრიული საშუალო ტიტრის სხვაობა ID-ში50 ველური ტიპის ფსევდოტიპური ვირუსის ვირუსებთან შედარებით. სტატისტიკური ანალიზები ჩატარდა Wilcoxon-ის შესატყვისი წყვილების ხელმოწერილი რანგის ტესტის გამოყენებით.
ერთად, ჩვენმა მონაცემებმა აჩვენა, რომ ახლად აღიარებული ინტერესის მქონე ლამბდას ცილა, რომელიც ძალიან ცირკულირებს ჩილესა და სამხრეთ ამერიკის ქვეყნებში, ატარებს მუტაციებს, რომლებიც ანიჭებენ გაზრდილ ინფექციურობას და უნარს გაექცეს CoronaVac-ის მიერ გამოწვეულ ნეიტრალიზებელ ანტისხეულებს.
